近日，Advanced Science（IF=15.1）在线发表了伟德国际1946官方网周哲敏教授团队的研究成果“A New-Generation Base Editor with An Expanded Editing Window for Microbial Cell Evolution In Vivo Based on CRISPR‒Cas12b Engineering”（Hao et al., Adv. Sci., 2024, DOI: 10.1002/advs.202309767）。2019级博士生郝文亮（已毕业，现为清华大学化学工程系2023级博士后）为论文的第一作者，周哲敏教授和韩来闯助理研究员为论文的共同通讯作者。
图1 新一代瘦身版碱基编辑器开发摘要
碱基编辑器（Base editor，BE）作为一种新兴的靶向突变技术已经被广泛用于微生物细胞进化、蛋白质工程、代谢工程以及合成生物学的其他方面研究。对于微生物细胞进化而言，往往需要在一个较大的编辑窗口内，通过产生大量突变以提高表型的多样性。然而，微生物细胞中现存的BE编辑窗口比较狭窄（仅5~7 nt），至多发生2~3个氨基酸的替换，限制了BE的应用。尽管通过sgRNA的延长以及多类型脱氨酶的融合可以在一定程度上扩展BE的编辑窗口，但是其在靶标处的可编辑范围依然有限。
针对上述关键科学问题，本研究提出使用分子量较小的Cas12b构建BE系统，其与脱氨酶融合可以尽量减弱Cas蛋白的大空间位阻对于脱氨酶编辑窗口的限制效应。首先在重要模式工业菌株枯草芽孢杆菌中构建了CRISPR/BhCas12b系统，结合多序列比对及BhCas12b/sgRNA复合体结构预测模型，确定BhCas12b上负责DNA切割的三个关键残基（D574，D828和D952），并通过失活突变构建了完全丧失DNA切割能力、但保留与sgRNA高效结合及定位靶标基因能力的dBhCas12b。
图2 序列-结构导向的dBhCas12b构建
将胞嘧啶脱氨酶CDA融合到dBhCas12b的N端并额外添加两个拷贝的UGI（CDA-dBhCas12b-UGI-UGI）成功构建CBE体系，可以在16 nt的编辑窗口诱发C到T的突变。另外，将改造后的腺苷脱氨酶ABE融合到dBhCas12b的N端构建ABE体系，可以在14 nt的编辑窗口高效诱发的A到G突变。新一代CBE和ABE编辑窗口分别是目前报道的2~5倍。
将CBE系统用于枯草芽孢杆菌目标基因RBS+Spacer的大窗口（15 nt）共进化，构建RS组合突变文库，筛选得到eGFP表达强度提升68.1倍的最佳RS组合突变。另外，在E. coli中也测试了本CBE系统的宿主适用性，结果发现，该CBE在E. coli也同样适用，能够在PAM两端（以PAM为0点）同时诱导C到T的突变（C-15~C26），编辑窗口高达41 nt，甚至超出了protospacer（23 nt）。全基因组测序证明，dBhCas12b-CBE并没有发生可检测的脱靶效应，证明了该系统是一个高精度的基因组编辑器。
图3 RBS+Spacer的原位进化提高基因表达水平
利用新一代BE编辑窗口的优势，设计构建了靶向E. coli Tat分泌系统的sgRNA文库用于开发高分泌性能的E. coli底盘。经过基因组编辑以及荧光筛选实验分析，获得了一株蛋白分泌性能提升6.49倍的E. coli底盘，证明了该CBE系统在微生物底盘宿主进化中的应用潜力。测序结果显示，在E. coli宿主中新一代BE的编辑窗口是目前已报道BE的8~10倍，是迄今微生物系统中编辑窗口最宽的BE。
本项目得到国家重点研发计划（2023YFC3402400）等项目的资助。
图4 高分泌性能E. coli底盘开发
